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本试剂盒可直接对蛋白质、多肽及其它含游离氨基的配体上标记HRP。试剂盒中HRP已预先活化，可直接用于偶联实验，例如直标一抗在免疫实验中无需二抗，免去繁琐的孵育和洗涤步骤，节省时间。偶联产物在4℃下可稳定保存1个月。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种44,173.9道尔顿糖蛋白，带有6个赖氨酸残基，可以与待标记分子结合。当与适当的底物一起孵育时，会生成带有颜色，荧光或发光衍生物的标记分子偶联体，我们可以对其进行检测和定量分析。HRP通常用于偶联物中，以确定分子靶标的存在。HRP具有单体特性，能简便地生成有色物，常用于ELISA和免疫组织化学等实验。

活化的辣根过氧化物酶（HRP），其天然碳水化合物（糖）已被高碘酸盐轻度氧化以产生胺反应性醛基。活化的过氧化物酶的羰基自发地、有效地与抗体或其它蛋白质上的伯胺交联。该方法比其它胺反应性化学试剂，如戊二醛偶联更有效，戊二醛偶联常常导致聚合反应和更高程度的偶联失活。预活化的酶消除了从头开始制备和验证活化的过氧化物酶所固有的困难。

• 缓冲液中不能含有氨基成分，会影响偶联效果。叠氮化钠会破坏HRP，偶联缓冲液不能含有普罗克林，少量BSA和明胶不会影响偶联效果，建议使用PBS作为缓冲液。若样本中含有可能干扰标记的物质，建议用PBS置换缓冲液，具体方法为：将样本加入超滤管中，加入200～150μL PBS，12000g、4℃、离心10min，弃掉滤液；再次补齐PBS，12000g、4℃、离心10min；离心后取出超滤管内芯，倒置于干净外管中，4000g、4℃、离心2min，收集置换缓冲液后的样本。

• 标记蛋白
  待标记样本与HRP最佳摩尔比为1:1至1:4。我们建议以约1:3的比例进行偶联实验。您可以通过预实验确定最佳摩尔比。以标记抗体为例，从1:1到1:4推荐用量如下。
  

  规格	HRP量	抗体量(抗体:HRP)			最佳标记体系
  		1:1	1:3	1:4
  3T	3×75μg	3×300μg	3×100μg	3×75μg	3×100μL
  10T	750μg	3mg	1mg	750μg	1mL

  • 考虑到分子量（160,000∶40,000），对于1mg HRP，需要添加1～4mg抗体。
    
  • 为保证偶联效果，建议样本的原始浓度应大于1mg/mL。对于其它规格，请参阅上表进行等比放大。
    
  • 以10T试剂盒为例，推荐摩尔比为1:3。其它规格，试剂用量依据说明书进行等比调整。如果需要调整摩尔比，请保持HRP量不变，更改待标记样本和缓冲液用量。
  • 向待标记样本中加入30μL HRP标记缓冲液，用移液器温和混匀。
    
  • 吸取22.5μL 活化HRP偶联液至步骤a反应液中，加去离子水至300μL。温和混匀，室温（20～25℃），避光，静置2h。
    
  • 向终止液干粉中加入1mL去离子水制作100×终止液。100×终止液可置于室温保存，但需在48小时内用完。100×终止液在使用前需稀释100倍制成1×终止液。
    
    • 为了防止气体在管内聚集，瞬间膨胀，导致安全隐患，请开盖配制终止液；
      
    • 不同规格的试剂盒，配制100×终止液的去离子水用量保持不变（1mL）。
  • 向步骤b反应液中加入45μL 1×终止液，温和混匀，4℃，避光放置2h。偶联物可直接用于下游实验。
• 偶联物储存
  偶联物4℃避光条件下可稳定保存一个月。若需长期储存，请分装并于-20℃下避光保存，避免反复冻融，可加入同体积甘油。